ما الذي يكشفه الاختبار
يكشف هذا الاختبار، شأنه شأن تفاعل البوليميراز المتسلسل بالنسخ العكسي (RT-PCR) لجين N، فيروس طاعون المجترات الصغيرة (PPRV) من السلالات الوراثية (lineages) الأربع جميعها، وهو مبني على المقايسة التي نشرها Forsyth وزملاؤه أصلاً (2003)، وتتكون مرحلته الأولى من تفاعل RT-PCR في أنبوب واحد بالبادئتين F1b وF2d المصمَّمتين على جين F.
المتطلبات
يحتاج الاختبار إلى عدة RT-PCR أحادية الخطوة، وماء مقطر، والبادئات المناسبة، وجهاز تدوير حراري (thermal cycler)، وكواشف ومعدات للرحلان الكهربائي على هلام الآغاروز، وقد جرى التحقق من صلاحية البروتوكول الذي يورده دليل المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) لهذا الاختبار باستخدام عدة تجارية، مع إمكان اعتماد كواشف أخرى بعد اختبارها والتحقق منها بالشكل المناسب. ويشترط الدليل في كل مقايسة أربعة عناصر على الأقل: العينة، وشاهد سلبي، وشاهد إيجابي، وشاهد خالٍ من القالب (no-template control) يحلّ فيه ماء خالٍ من إنزيم RNase محل عينة الحمض النووي الريبي.
تفسير النتيجة
يُحلَّل 10 ميكرولترات من ناتج التفاعل على هلام آغاروز بتركيز 2% في محلول TBE أو TAE، فإذا كان الحمض النووي الريبي للفيروس موجوداً ضُخِّم إلى قطعة DNA طولها 447 زوجاً قاعدياً (bp)، وإن لم يظهر ناتج DNA أو ظهر ناتج ضعيف جداً أمكن إجراء جولة ثانية من PCR لزيادة كمية الناتج. وتُجرى هذه الجولة الثانية PCR متداخلاً (nested PCR) بالبادئتين F1 وF2 وبأي كواشف وإنزيم جيدة النوعية جرى التحقق من صلاحيتها، ويُحلَّل ناتجها على هلام آغاروز 2%، فإن وُجد ناتج PCR للفيروس ظهر في قطعة DNA طولها 371 زوجاً قاعدياً.
استخدامات إضافية
يمكن تنقية ما يتبقى من ناتج DNA للعينات التي ثبتت إيجابيتها وإخضاعه لتحديد التسلسل (DNA sequencing).