عزل فيروس إيريدو الدنيس الأحمر في مزارع الخلايا مع التعريف بالتألق المناعي غير المباشر (IFAT) أو بتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) (Red sea bream iridovirus virus isolation in cell culture with IFAT or PCR identification) طريقة يُعرَّف فيها الفيروس، بعد ظهور الأثر الخلوي المرضي في المزرعة، بإحدى وسيلتين أو بكلتيهما. يكشف هذا الاختبار في المزرعة فيروس إيريدو الدنيس الأحمر (RSIV) أو فيروس التهاب الطحال والكلية الناخر (ISKNV)، وعندها يكون المرض هو مرض إيريدوفيروس الدنيس الأحمر (RSIVD) بحسب دليل المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH).
ما الذي يكشفه الاختبار
تذكر المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) أن مرض RSIVD ينتج عن العدوى بفيروس إيريدو الدنيس الأحمر، وأن فيروس التهاب الطحال والكلية الناخر (ISKNV) يسبب المرض أيضاً، وهو من الفيروسات المرتبطة بـ RSIV لكنه متميز عنه. يوضح دليل المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) أن الجسم المضاد وحيد النسيلة الموجَّه ضد RSIV يتعرف في اختبارات التألق المناعي على RSIV وISKNV معاً، ولا يتعرف على فيروسات الرانا السمكية من فصيلة Iridoviridae. بحسب دليل المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) لا تتوافر حتى الآن طرق مصلية تقوم على مصل الأسماك المصابة بمرض RSIVD.
العينة
تعدّ المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) أنسجة الطحال و/أو الكلية من الأسماك المريضة عينات مناسبة لعزل الفيروس. قد يكون الطحال أنسب عضو لتحضير لطاخات IFAT بحسب دليل المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH)، مع أن الخياشيم وأعضاء حشوية أخرى يمكن استعمالها أيضاً. تُحفظ الأسماك عند 4 درجات مئوية إذا استُعملت خلال 24 ساعة، أو عند −80 درجة مئوية لفترات أطول قد تبلغ بضع سنوات، بحسب ما يذكره دليل المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH). تنص المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) على أن جثث الأسماك التي تظهر عليها علامات تحلل نسيجي متقدم لا تصلح للفحص بأي طريقة. عند التعريف بعد العزل تكون العينة المفحوصة بـ IFAT طبقات خلايا مصابة ثبّتت بالأسيتون وظهر فيها الأثر الخلوي المرضي، بينما يُجرى PCR على طحال الأسماك المصابة أو على الرواشح الطافية لمزارع الخلايا التي ظهر فيها الأثر المرضي.
مبدأ الاختبار
يجري عزل RSIV وISKNV من الأسماك البحرية على خط خلايا زعنفة الغرنت (GF)، أما عزلهما من أسماك المياه العذبة كالجوراميّ فصعب بحسب المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH). توصي المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) بتنمية الخلايا في وسط إيجل القاعدي مع مصل جنين البقر عند 25 درجة مئوية في حضّانة منضبطة الحرارة، لضمان نجاح عزل RSIV لاحقاً. يُتابَع سير العدوى في الشواهد الإيجابية وفي المزارع الملقّحة بفحص مجهري يومي لمدة 10 أيام، ويوصي الدليل باستعمال المجهر ذي تباين الطور. تنص المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) على أن الفيروس المستعمل شاهداً إيجابياً يمكن الحصول عليه من المختبر المرجعي لمرض إيريدوفيروس الدنيس الأحمر (RSIVD)، وعلى أن الخلايا غير المصابة تُستعمل شواهد سلبية. يُجرى IFAT مباشرة بعد عزل الفيروس في مزرعة الخلايا، أما في التعريف بـ PCR فتُحلَّل نواتج التضخيم بالرحلان الكهربائي على هلام الأغاروز. تذكر المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) أن زوج البادئات 4-F و4-R، يتمتع بحساسية كافية تجاه RSIV لكنه لا يصلح لتضخيم DNA الخاص بـ ISKNV.
الاستعمالات
تذكر المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) أنه لا توجد طريقة كشف راسخة للترصد، لأن حالة الحمل الصامت للعوامل المسببة لم تُبحث بعد. ترى المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) أن الطريقتين المقترحتين مبدئياً للترصد هما عزل الفيروس يتبعه IFAT أو PCR المتداخل.
تفسير النتيجة
يوجب دليل المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) البدء بإجراءات التعريف فور ظهور الأثر الخلوي المرضي في المزارع الملقّحة بتخفيفات متجانس العينة. إذا لم يظهر أثر مرضي بعد 10 أيام من التحضين رغم سيره الطبيعي في الشواهد الفيروسية، تُعاد زراعة المزارع الملقّحة فرعياً لمدة 7 أيام أخرى، وإذا لم يظهر الأثر بعد ذلك جاز إعلان نتيجة الاختبار سلبية. عندما يفشل الشاهد الفيروسي في إحداث الأثر المرضي، تنص المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) على إعادة العملية بخلايا حساسة طازجة وبدفعات جديدة من العينات. في IFAT على المزرعة يجب أن تعطي الشواهد الإيجابية والسلبية النتائج المتوقعة قبل أي ملاحظة أخرى، وتُعدّ النتيجة إيجابية حين يظهر تألق منتشر في السيتوبلازم كله. يُوصَف في دليل المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) بالمعيار «الذهبي» الأثر الخلوي المرضي الذي تكثر فيه الخلايا المتضخمة ويُؤكَّد فيه وجود الفيروس بـ IFAT. وفق المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH)، تشير نتيجة PCR الإيجابية بزوج البادئات 1-F و1-R، متى أُكِّدت نوعيتها بالتسلسل، إلى وجود RSIV أو ISKNV وإلى أن المرض هو RSIVD. لا يمكن تعريف RSIV (وربما ISKNV كذلك) باختبارات التعادل، لأن الأمصال المحضّرة بتمنيع الأرانب تحوي قدراً قليلاً من الأضداد المعادِلة، وفق المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH).
توافر الكواشف
تذكر المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) أن الكواشف والمواد الحيوية اللازمة للاختبار متاحة من المختبر المرجعي للمرض أو من مصادر تجارية.