تفاعل البوليميراز المتسلسل الآني بالنسخ العكسي (RT-PCR الآني) مجموعة طرق جزيئية يذكر دليل المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) أنها طُوّرت للكشف عالي الحساسية والنوعية عن المادة الوراثية لفيروس مرض الخيل الأفريقي. يصف دليل WOAH طريقتي RT-PCR الآني اللتين وضعهما Agüero وزملاؤه (2008) وGuthrie وزملاؤه (2013) بأنهما مُصادَق عليهما لإصدار شهادات الحيوانات الفردية قبل نقلها في سياق مرض الخيل الأفريقي.
ما الذي يكشفه الاختبار
مرض الخيل الأفريقي، كما يعرّفه دليل WOAH، عدوى تنقلها المفصليات إلى الخيليات دون أن تسري بالتماس، ومسببها فيروس orbivirus من فصيلة Reoviridae مادته الوراثية حمض نووي ريبي مزدوج السلسلة. يُدرج دليل WOAH تفاعل البوليميراز المتسلسل بالنسخ العكسي بين الطرق التي أتاحت كذلك التعرف على الحمض النووي الريبي لفيروس مرض الخيل الأفريقي. تستهدف مقايسة Agüero لفيروس مرض الخيل الأفريقي، بحسب دليل WOAH، القطعة الجينية 7 المشفّرة للبروتين VP7، وهي قادرة على كشف جميع أنماط الفيروس وسلالاته المعروفة المنتشرة حالياً. يذكر دليل WOAH أن الطريقة المقتبسة من Guthrie وزملائه (2013) تكشف كل أنماط فيروس مرض الخيل الأفريقي وسلالاته المعروفة المتداولة حالياً، وتستهدف هي أيضاً القطعة الجينية 7.
العينة
يحدد دليل WOAH العينات المفضلة لتشخيص مرض الخيل الأفريقي بالدم الكامل غير المتخثر من الحيوانات المريضة في بداية المرحلة الحموية، وبقطع صغيرة من الطحال والرئة والعقد اللمفية من الحيوانات النافقة. يذكر دليل WOAH أن وجود فيروس مرض الخيل الأفريقي في خلايا الحشرات المستعملة للعزل يمكن كشفه في السائل الطافي بعد 5 إلى 7 أيام بتفاعل RT-PCR الآني. يذكر دليل WOAH أن فيروساً معطَّلاً من السلالات المرجعية للأنماط المصلية من 1 إلى 9 لفيروس مرض الخيل الأفريقي يمكن الحصول عليه من المختبر المرجعي للمنظمة في إسبانيا لإعداد طريقة الكشف بتفاعل RT-PCR. يربط دليل WOAH مستوى الاحتواء الذي ينبغي أن تُجرى ضمنه معالجة فيروس مرض الخيل الأفريقي في المختبر بنتيجة تحليل المخاطر الحيوية.
مبدأ الاختبار
تعتمد طرق RT-PCR الآني لفيروس مرض الخيل الأفريقي، كما يصفها دليل WOAH، على زوج من البادئات ومسبار موسوم مأخوذة من تسلسلات محفوظة في القطعة الجينية 3 أو 5 أو 7 من الفيروس. يذكر دليل WOAH أن مقايسة RT-PCR آنية ثنائية وُصفت لفيروس مرض الخيل الأفريقي تستهدف القطعتين الجينيتين 7 و8، المشفّرتين للبروتينين NS1 وNS2 على التوالي. يقارن دليل WOAH بين الطريقتين فيذكر أن تفاعل RT-PCR القائم على الهلام وتفاعل RT-PCR الآني يكشفان كلاهما السلالات المرجعية للأنماط المصلية التسعة لفيروس مرض الخيل الأفريقي، وأن الطريقة الآنية تمتاز بسرعة التحليل وحساسية أعلى وملاءمة للأتمتة عالية الإنتاجية.
الاستعمالات
يذكر دليل WOAH أن مقايسات RT-PCR آنية نوعية للنمط تعتمد مسابر موسومة طُوّرت حديثاً لتنميط فيروس مرض الخيل الأفريقي. يرى دليل WOAH أنه ينبغي اللجوء مبكراً قدر الإمكان خلال فاشية مرض الخيل الأفريقي إلى التعادل الفيروسي أو تفاعل RT-PCR النوعي للنمط أو تحديد التسلسل، للتعرف على النمط المصلي واختيار اللقاح الصحيح. يُبقي دليل WOAH التعادل الفيروسي معياراً ذهبياً ينبغي الاحتفاظ به لتحديد النمط المصلي لعزلات فيروس مرض الخيل الأفريقي، مع إقراره بأن الطرق الجزيئية تنمّط الفيروس سريعاً في كثير من العينات الحقلية الإيجابية. يذكر دليل WOAH أنه ينبغي، متى أمكن، إجراء أكثر من اختبار عند تشخيص فاشية لمرض الخيل الأفريقي، وخاصة الحالة الأولى فيها.
تفسير النتيجة
يُنبّه دليل WOAH إلى أن النتيجة الإيجابية لتفاعل RT-PCR لا تدل بالضرورة على وجود فيروس مرض الخيل الأفريقي المعدي، إذ يبقى الحمض النووي للفيروس قابلاً للكشف حتى بعد أن يفقد الفيروس حيويته. استُعملت في تقييم طريقة RT-PCR الآني لفيروس مرض الخيل الأفريقي على الدم الكامل، كما يذكر دليل WOAH، 503 عينات دم من خيل منفردة مصابة بالحمى ومعها علامة سريرية نموذجية واحدة أو أكثر لمرض الخيل الأفريقي لتمثيل الحالات المشتبه بها. يذكر دليل WOAH أن الحالات السلبية لمرض الخيل الأفريقي في تقييم طريقة RT-PCR الآني مثّلتها عينات دم من مجموعتين منفصلتين من الخيل السليمة غير المحصنة ضد المرض، يُستبعد بشدة تعرضها للعدوى الطبيعية. يذكر دليل WOAH أن الوسيط للنوعية التشخيصية لطريقة RT-PCR الآني لفيروس مرض الخيل الأفريقي تجاوز 99.9%، وأن وسيط حساسيتها التشخيصية تجاوز 97.8%، في تقييمها على عينات الدم الكامل من الخيل مقارنةً بعزل الفيروس.
مكانه في المعايير الدولية
يعدّ جدول دليل WOAH لمرض الخيل الأفريقي تفاعل RT-PCR الآني موصى به مع وجود قيود للترصد، ومناسباً في ظروف محدودة جداً لإثبات خلو مجموعة حيوانية من العدوى ولدعم سياسات الاستئصال، وغير مناسب لتحديد الحالة المناعية بعد التحصين. يُعدّ تطبيق مزيج من طرق التعرف على العامل الممرض على عينة سريرية واحدة أمراً موصى به في فصل مرض الخيل الأفريقي من دليل WOAH. يذكر دليل WOAH أن مقايسة RT-PCR الآنية النوعية للمجموعة لفيروس مرض الخيل الأفريقي وُجدت، في اختبار دولي مشترك بين المختبرات نُظّم عام 2015 برعاية شبكة المختبرات المرجعية للمنظمة، من بين البروتوكولات التي احتلت المراتب العليا إلى جانب بروتوكولات أخرى. يذكر دليل WOAH أن مقايسة RT-PCR الآنية النوعية للمجموعة لفيروس مرض الخيل الأفريقي استعملتها المختبرات المرجعية الوطنية المشاركة من الدول الأعضاء في الاتحاد الأوروبي بنتائج جيدة جداً في اختبارات الكفاءة السنوية للفترة من 2009 إلى 2015. يذكر دليل WOAH أن طريقتي Agüero وGuthrie للكشف عن فيروس مرض الخيل الأفريقي بتفاعل RT-PCR الآني كشفتا بشكل صحيح جميع السلالات الممثلة في الاختبار الدولي المشترك، مع حساسية عالية في تحليل العينات الحقلية. بلغت قابلية تكرار نتائج طريقة Agüero لتفاعل RT-PCR الآني لفيروس مرض الخيل الأفريقي في الاختبار الدولي المشترك، بحسب دليل WOAH، ما لا يقل عن 93.55%، مع تعرّف صحيح على كل العينات الإيجابية والسلبية في اللوحة، وكشفت جميع المختبرات تخفيفات العينات الإيجابية حتى 10⁻⁵ على الأقل. يذكر دليل WOAH أن طريقة Guthrie لتفاعل RT-PCR الآني لفيروس مرض الخيل الأفريقي القائمة على المسبار أظهرت في الاختبار الدولي المشترك حساسية تزيد على 88.1% ونوعية بلغت 100%، وتعرّفت بشكل صحيح على كل العينات الإيجابية والسلبية في اللوحة.