يكشف تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل (nested PCR) بصيغته المتعددة (multiplex) طفيليي B. bovis وB. bigemina بالاعتماد على RAP-1 وقطعة SpeI-AvaI على التوالي، وفق الإجراء الذي تعرضه المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH). ترى المنظمة أن هذا التفاعل مناسب للتجارة الدولية، ولا سيما بالنسبة إلى B. bovis التي تُظهر عادةً نسبة طفيليات منخفضة أو حالة حمل للعدوى.
مقارنة بالاختبارات الأخرى
تذكر المنظمة أن حساسية PCR المتداخل أعلى من حساسية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) العادي. تتيح المنظمة بديلًا عن الصيغة المتعددة هو PCR المتداخل الأحادي (simplex)، الذي يكشف B. bovis أو B. bigemina كلًّا على حدة باستعمال بادئات النوع المعني فقط.
المبدأ والإجراء
يُعدّ RAP-1 لطفيلي B. bovis وAMA-1 لطفيلي B. bigemina جينين واسعَي الاستعمال في PCR المتداخل، من بين جينات عدة تُستخدم فيه، بحسب المنظمة. يستند الإجراء الذي تعرضه المنظمة إلى طريقة Figueroa وزملائه (1993) مع تعديلات تكيّفه للكشف المتعدد.
العينة
تُجمع عينة الدم الكامل في أنبوب جمع مفرّغ يحتوي على EDTA، ويمكن أيضًا تحضير عينات الحمض النووي من الدم المصاب بعُدد تجارية لاستخلاص الحمض النووي، بحسب المنظمة.
تفسير النتيجة
تنص المنظمة على أن العينات الإيجابية ينبغي أن تعطي نواتج بالحجم المتوقع، وهو 170 زوجًا قاعديًا لطفيلي B. bigemina و298 زوجًا قاعديًا لطفيلي B. bovis، على غرار الشواهد الإيجابية. توجب المنظمة إعادة المقايسة إذا بقي الشاهد الإيجابي سلبيًا أو ظهرت الشواهد السلبية إيجابية.