طريقة البيروكسيداز المناعي في الصفائح الدقيقة (microplate immunoperoxidase method) طريقة فحص جماعي تكشف فيروس الإسهال الفيروسي البقري في عينات المصل، ويُدرجها فصل الإسهال الفيروسي البقري في دليل المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) لعام 2024 منسوبةً إلى عمل Meyling المنشور عام 1984. يصف دليل WOAH عزل فيروس الإسهال الفيروسي البقري بأنه تلقيح العينات على مزارع خلوية قابلة للعدوى، ثم استعمال طرق الوسم المناعي لإظهار تكاثر الفيروس في تلك المزارع.
ما الذي يكشفه الاختبار
يُدرج دليل WOAH فيروس الإسهال الفيروسي البقري في فصيلة Flaviviridae تحت جنس Pestivirus، ويذكر أن مادته الوراثية حمض نووي ريبي خطي وحيد السلسلة موجب الاتجاه. يذكر دليل WOAH أن لنوعي فيروس الإسهال الفيروسي البقري Pestivirus bovis وPestivirus tauri نمطين حيويين، ممرضاً للخلايا وغير ممرض لها، وأن السلالات غير الممرضة للخلايا هي التي تُصادَف عادةً في العدوى الحقلية وهي محور العزل التشخيصي في المزارع الخلوية. تكون الإصابة المستديمة بفيروس الإسهال الفيروسي البقري، وفق دليل WOAH، مآل كل حيوان تقريباً يبقى حياً بعد عدوى داخل الرحم في الثلث الأول من الحمل.
العينة
يعدّ دليل WOAH خلايا الطبقة البيضاء والدم الكامل والكريات البيض المغسولة والمصل عينات مناسبة لعزل فيروس الإسهال الفيروسي البقري من الحيوانات الحية، والمصل هو العينة التي وُضعت لها طريقة الفحص الجماعي في الصفائح الدقيقة. ينبّه دليل WOAH إلى أن عزل فيروس الإسهال الفيروسي البقري لا يكشف إلا الفيروس المُعدي، وهو ما يفرض حدوداً معينة على جودة العينة. يحذّر دليل WOAH من أن الأضداد الأمية قد تتداخل مع عزل فيروس الإسهال الفيروسي البقري من مصل العجول الصغيرة، وأن وجود هذه الأضداد لدى العجول دون 4-5 أشهر من العمر قد يشوّش العزل من الدم فيما يُسمّى الفجوة التشخيصية.
مبدأ الاختبار
يذكر دليل WOAH أن فيروس الإسهال الفيروسي البقري يمكن عزله في عدد من مزارع الخلايا البقرية وحيدة الطبقة، مثل خلايا الكلية أو الرئة أو الخصية أو القرينات الأنفية. تُستكمل طرق عزل فيروس الإسهال الفيروسي البقري التقليدية، وفق دليل WOAH، بخطوة تلوين مناعي ختامية تكشف نمو الفيروس غير الممرض للخلايا، ويكون التلوين بالبيروكسيداز أكثر استعمالاً من التألق المناعي. يذكر دليل WOAH أن شواهد إيجابية وسلبية معروفة تُدرج مع العينات في طريقة البيروكسيداز المناعي لكشف فيروس الإسهال الفيروسي البقري. يذكر دليل WOAH أن عزل فيروس الإسهال الفيروسي البقري يُرجَّح أن يتطلب تمريرة أو أكثر في المزارع الخلوية بحسب نوع العينة والغرض من الفحص، وأن الحيوانات المصابة إصابة مستديمة يسهل التعرف عليها بفحص الدم أو المصل. يذكر دليل WOAH أن الطافي المأخوذ من التمريرة الأخيرة لمزرعة الخلايا يمكن، بديلاً عن التلوين، أن يُفحص بتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي للكشف عن فيروس الإسهال الفيروسي البقري. يشترط دليل WOAH أن يكون مصل الأجنة البقري المستعمل في زراعة الخلايا خالياً من فيروس الإسهال الفيروسي البقري ومن الأضداد المعادلة له، ويعدّ الخلو من هذه الأضداد مساوياً في الأهمية للخلو من الفيروس أو ربما أهم. يذكر دليل WOAH أن معظم دفعات مصل الأجنة البقري المجموعة تجارياً تحتوي أضداداً لفيروسات جنس Pestivirus، بمستويات قد لا تكاد تُكشف لكنها تكفي لتثبيط عزل فيروس الإسهال الفيروسي البقري.
الاستعمالات
كان عزل الفيروس في المزارع الخلوية، كما يذكر دليل WOAH، الأداة التي اعتُمد عليها كثيراً في الماضي للتعرف على الحيوانات المصابة إصابة مستديمة بفيروس الإسهال الفيروسي البقري.
تفسير النتيجة
يحدد دليل WOAH ما ينبغي أن تُظهره الشواهد في طريقة البيروكسيداز المناعي لفيروس الإسهال الفيروسي البقري: لوناً بنياً محمراً في سيتوبلازم الخلايا المصابة في الشاهد الإيجابي، وتلويناً معدوماً أو ضئيلاً في الخلايا غير المصابة في الشاهد السلبي. يذكر دليل WOAH أن الخلايا الإيجابية لفيروس الإسهال الفيروسي البقري تُظهر تلويناً بنياً محمراً في السيتوبلازم. يصف دليل WOAH عزل فيروس الإسهال الفيروسي البقري بأنه موثوق جداً متى أُجري بمستوى عالٍ. يقارن دليل WOAH بين عزل فيروس الإسهال الفيروسي البقري الذي يستغرق أسابيع وتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي الذي يمكن إنجازه في ساعات قليلة، ويذكر أن لهذا التفاعل مزايا منها حساسية أعلى، وأنه يتغلب إلى حد كبير على مشكلات تواجه العزل.
مكانه في المعايير الدولية
يذكر دليل WOAH أن صيغ إجراء عزل فيروس الإسهال الفيروسي البقري كثيرة، وأنه ينبغي ضبط كل منها لتبلغ أقصى حساسية في كشف مستحضر فيروسي قياسي. يصف دليل WOAH فيروس الإسهال الفيروسي البقري غير الممرض للخلايا بأنه ملوِّث شائع للأنسجة البقرية، ويشترط فحص المزارع الخلوية بانتظام للتحقق من خلوها من الفيروس الدخيل. يقيّم جدول طرق التشخيص في فصل الإسهال الفيروسي البقري من دليل WOAH ملاءمة كل طريقة لكل غرض بأربع درجات: موصى بها، وموصى بها مع قيود، ومناسبة في ظروف محدودة جداً، وغير مناسبة لذلك الغرض.