تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في الوقت الحقيقي (real-time polymerase chain reaction) طريقة جزيئية يخصص لها فصل الإسهال الفيروسي البقري في دليل المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) قسماً مستقلاً للكشف عن فيروس الإسهال الفيروسي البقري في المني. يصف دليل WOAH فائدة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي في إثبات خلو عينات المني من فيروس الإسهال الفيروسي البقري بأنها كبيرة جداً، ويذكر أن السرعة ليست ميزته الوحيدة، وأن نتائجه كثيراً ما تتفوق على عزل الفيروس في المزرعة الخلوية، خصوصاً مع المستويات المنخفضة من الفيروس التي قد توجد لدى بعض الثيران.
ما الذي يكشفه الاختبار
يصف دليل WOAH فيروس الإسهال الفيروسي البقري بأنه فيروس من جنس Pestivirus في فصيلة Flaviviridae، جينومه سلسلة مفردة خطية موجبة الاتجاه من الحمض النووي الريبي، وتربطه قرابة وثيقة بفيروس حمى الخنازير الكلاسيكية (Pestivirus suis) وفيروس مرض الحدود في الأغنام (Pestivirus ovis). يذكر دليل WOAH أن الحيوانات المصابة إصابة مستديمة بفيروس الإسهال الفيروسي البقري هي المستودع الرئيسي للفيروس في القطيع، وأنها تطرح كميات كبيرة منه في البول والروث والإفرازات والحليب والمني. صُممت مقايسة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي الشاملة لجنس Pestivirus، كما يعرضها دليل WOAH، لتغطي الأنماط الثلاثة من فيروس الإسهال الفيروسي البقري بكل سلالاتها (Pestivirus bovis وPestivirus tauri وPestivirus brazilense)، ويمتد كشفها إلى Pestivirus suis وبعض سلالات Pestivirus ovis وأغلب فيروسات الجنس غير النمطية. يذكر دليل WOAH أن مقايسة فيروس الإسهال الفيروسي البقري الشاملة تضخّم انتقائياً تسلسلاً طوله 208 أزواج قاعدية من المنطقة غير المترجمة في الطرف 5' من جينوم فيروسات جنس Pestivirus. يذكر دليل WOAH وجود مقايسات منشورة واسعة التفاعل عبر جنس Pestivirus تكشف جميع أنماط فيروس الإسهال الفيروسي البقري وبعض سلالات Pestivirus ovis وعدداً من الفيروسات غير النمطية، ويوصي بمقايسة حساسة واسعة التفاعل في التطبيقات التشخيصية لأن انتقال فيروسات الجنس المختلفة بين الأنواع يُصادَف أحياناً. يذكر دليل WOAH أن مقايسات تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي المعتمدة على مسابير الحمض النووي الموسومة بالفلورة يمكن أن تُستعمل أيضاً للتمييز بين فيروسات جنس Pestivirus، ومنها فيروس الإسهال الفيروسي البقري، وأن مقايسات خاصة بكل نوع يمكن تطبيقها لتنميط الفيروس عندما يلزم تحديده بدقة أكبر.
العينة
يذكر دليل WOAH أن تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي يتيح الكشف المباشر عن الحمض النووي الريبي لفيروس الإسهال الفيروسي البقري في طائفة واسعة من العينات تشمل المصل والدم الكامل والأنسجة والحليب والمني. يجيز دليل WOAH إرسال العينات مبرّدة إذا كانت ستُفحص بتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي وحده لكشف فيروس الإسهال الفيروسي البقري، بشرط أن تبقى باردة عند وصولها إلى المختبر. يذكر دليل WOAH أن الحساسية التحليلية العالية جداً لتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي تسمح باستعمال كميات أصغر بكثير من المني في كشف فيروس الإسهال الفيروسي البقري. يذكر دليل WOAH أن مشكلات مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل تكثر في عينات الدم المجموعة في أنابيب الهيبارين أكثر منها في أنابيب EDTA عند فحص فيروس الإسهال الفيروسي البقري.
مبدأ الاختبار
يذكر دليل WOAH أن تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي القائم على الهلام استُعمل في الماضي لكشف الحمض النووي الريبي لفيروس الإسهال الفيروسي البقري لأغراض تشخيصية، لكنه كثيف العمل نسبياً ومكلف وعرضة للتلوث المتبادل. يذكر دليل WOAH أن طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي أو الكمّي المعتمدة على المسابير خففت كثيراً مشكلات الطريقة القائمة على الهلام في كشف فيروس الإسهال الفيروسي البقري، وأنها أعلى حساسية منها ويمكن إنجازها في ساعات قليلة. يصف دليل WOAH تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي لكشف فيروس الإسهال الفيروسي البقري في المني بأنه يستعمل زوجاً من البادئات النوعية للتسلسل لتضخيم الحمض النووي الريبي الهدف، ومسباراً قليل النوكليوتيدات من نوع النوكلياز 5' لكشف النواتج المضخَّمة. يذكر دليل WOAH أن المسبار المستعمل في تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي لفيروس الإسهال الفيروسي البقري قليل نوكليوتيدات مفرد ونوعي للتسلسل، موسوم بصبغتين متفلورتين مختلفتين. يدعو دليل WOAH إلى احتياطات صارمة لتجنب تلوث نظام فحص فيروس الإسهال الفيروسي البقري ومناطق المختبر العامة التي تُتداول فيها العينات وتُحضَّر بالأحماض النووية. يذكر دليل WOAH أن مصادر التلوث في فحص المني بتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي لكشف فيروس الإسهال الفيروسي البقري قد تشمل انتقال النواتج من العينات الإيجابية، والأشيع منها التلوث المتبادل بنواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل من أعمال سابقة.
الاستعمالات
يذكر دليل WOAH أن الحساسية التحليلية العالية لتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي تتيح فحص مجمّعات من العينات الفردية أو حليب الخزان المجمّع، وأن هذا النهج يمكّن من كشف وجود حيوان واحد أو أكثر مصاب إصابة مستديمة بفيروس الإسهال الفيروسي البقري في قطعان تضم مئات الأبقار. يرى دليل WOAH أن تجميع عينات الدم من العجول بين اليوم 7 واليوم 40 من العمر غير مناسب إذا تناولت لبأً يحتوي أضداداً لفيروس الإسهال الفيروسي البقري، ويذكر أن حساسية تفاعل البوليميراز المتسلسل قد تنخفض في هذه المدة وتفلت الحيوانات المصابة من الكشف. يذكر دليل WOAH أن كشف الحمض النووي الريبي لفيروس الإسهال الفيروسي البقري في خزعات الجلد يبقى في المقابل غير متأثر بأضداد اللبأ. يصف دليل WOAH تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي بأنه طريقة سريعة وموثوقة لكشف فيروس الإسهال الفيروسي البقري، أغلى قليلاً من طرق التلوين المناعي، ويمكن استعمالها أيضاً لفحص الطافي من التمريرة الأخيرة للمزارع الخلوية. يذكر دليل WOAH أن الحمض النووي الريبي لفيروس الإسهال الفيروسي البقري يمكن كشفه بمقايسات تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي التي تتميز بحساسية عالية وبقدرتها على كشف جينوم الفيروس غير المُعدي. يعدّ دليل WOAH مقايسات كشف الحمض النووي الريبي لفيروس الإسهال الفيروسي البقري مفيدة بوجه خاص لأنها سريعة وعالية الحساسية جداً ولا تعتمد على المزارع الخلوية.
تفسير النتيجة
يدعو دليل WOAH إلى الحذر في تفسير نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي لفيروس الإسهال الفيروسي البقري، مع أنه عالي الحساسية جداً ويمكن تطبيقه في فحص المواد الحيوية المستعملة في تصنيع اللقاحات، لأن كشف الحمض النووي الريبي الفيروسي لا يعني بذاته وجود فيروس مُعدٍ. يعدّد ملحق آراء الخبراء في دليل WOAH مزايا تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي لفيروس الإسهال الفيروسي البقري، فهو شديد الحساسية وسريع وعالي الإنتاجية وراسخ دولياً، ويكشف بحسب المقايسة جميع أنواع الفيروس، ويتيح بحسب المقايسة التمييز بين النمطين 1 و2، ويكشف العدوى المستديمة والعابرة. يرى ملحق آراء الخبراء في دليل WOAH أن كشف الحمض النووي الريبي لفيروس الإسهال الفيروسي البقري في خزعات الجلد لا يتأثر بالأضداد المكتسبة من الأم، وأن ذلك يسمح بالتعرف على الحيوانات المصابة إصابة مستديمة في وقت مبكر من حياتها. يذكر ملحق آراء الخبراء في دليل WOAH من حدود تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي لفيروس الإسهال الفيروسي البقري احتمال التلوث عند جمع العينة أو في المختبر بما يؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة، وحاجته إلى معدات متخصصة. يورد جدول ملحق بفصل الإسهال الفيروسي البقري في دليل WOAH أن أداء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي على عينات قطع الأذن والدم والحليب ثبت في الظروف الميدانية ضمن برامج مكافحة واسعة. يذكر جدول ملحق بفصل الإسهال الفيروسي البقري في دليل WOAH لتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي لفيروس الإسهال الفيروسي البقري، على عينات قطع الأذن والدم والمسحات الأنفية أو الفموية، حساسية تحليلية تقل عن 10 نسخ جينومية في التفاعل الواحد بحسب المقايسة، ودقة بلغت 98.73% على لوحة اختبار كفاءة من خمس عينات قطع أذن وخمس عينات مصل.
مكانه في المعايير الدولية
يعتمد جدول طرق التشخيص في فصل الإسهال الفيروسي البقري من دليل WOAH رموزاً لملاءمة كل طريقة لكل غرض: ثلاث علامات زائد لما هو موصى به، وعلامتان لما هو موصى به مع قيود، وعلامة واحدة لما يناسب في ظروف محدودة جداً، وعلامة الناقص لما لا يناسب الغرض.