تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لفيروس فقر الدم المعدي الخيلي (Equine infectious anaemia virus PCR) اختبار جزيئي يصف دليل المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) إحدى صيغه، وهي مقايسة متداخلة، لكشف الدنا الطليعي لفيروس فقر الدم المعدي الخيلي في الدم المحيطي للخيول. تعدّ دراسة نُشرت عام 2023 في مجلة Microbiology Spectrum كشف الحمض النووي بتفاعل البوليميراز المتسلسل طريقة مكمّلة جيدة لكشف العدوى بفيروس فقر الدم المعدي الخيلي.
ما الذي يكشفه الاختبار
تصف دراسة Microbiology Spectrum لعام 2023 فيروس فقر الدم المعدي الخيلي بأنه فيروس بطيء من فصيلة Retroviridae يصيب الخيليات، ويعرّف دليل WOAH فقر الدم المعدي الخيلي بأنه عدوى فيروسية مستديمة في الخيليات. يذكر دليل WOAH أن مقايسة لتفاعل البوليميراز المتسلسل بالنسخ العكسي في الوقت الحقيقي وُصفت أيضاً لفيروس فقر الدم المعدي الخيلي. طوّرت دراسة Microbiology Spectrum لعام 2023 تفاعل بوليميراز متسلسل كمياً في الوقت الحقيقي لكشف فيروس فقر الدم المعدي الخيلي يستهدف القطعة الواقعة بين الجينين tat وgag، وهي قطعة وجدتها الدراسة محفوظة نسبياً في جميع سلالات الفيروس المعروفة.
العينة
يذكر دليل WOAH أن تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل أثبت حساسيته في كشف السلالات الحقلية لفيروس فقر الدم المعدي الخيلي في خلايا الدم البيضاء للخيول المصابة، وأن حدّه الأدنى للكشف يبلغ عادةً نحو 10 نسخ جينومية من الدنا المستهدف. يذكر استعراض Sellon المنشور عام 1993 أن اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل على الخلايا وحيدة النوى في الدم المحيطي أو على خلايا الطبقة الشهباء قد تساعد في تأكيد تشخيص فقر الدم المعدي الخيلي إذا توافرت بادئات نوعية. ينقل Issel وزملاؤه، في مقالة نشرتها مجلة Veterinary Record عام 2013، عن Cappelli وزملائه (2011) أن الرنا الفيروسي في البلازما لم يكن قابلاً للكشف إلا في الحالات السريرية من فقر الدم المعدي الخيلي، في حين أمكن تضخيم الدنا الطليعي بتفاعل البوليميراز المتسلسل حين استُعمل دنا الخلايا وحيدة النوى في الدم قالباً.
مبدأ الاختبار
يشرح دليل MSD البيطري أن فيروس فقر الدم المعدي الخيلي يحمل نسختين من جينوم من الرنا أحادي السلسلة يُنسخ عكسياً بعد العدوى إلى دنا طليعي يندمج لاحقاً في جينوم المضيف. يذكر دليل WOAH أن طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل لفقر الدم المعدي الخيلي تعتمد على تسلسلات بادئات مأخوذة من منطقة gag في الجينوم الطليعي للفيروس.
الاستعمالات
يعدّد دليل WOAH من الظروف التي قد يُستعمل فيها تفاعل البوليميراز المتسلسل لكشف العدوى بفيروس فقر الدم المعدي الخيلي في الخيول تعارضَ نتائج الاختبارات المصلية، والاشتباهَ بالعدوى مع نتائج مصلية سلبية أو مشكوك فيها، واستعمالَه اختباراً مكمّلاً للمصليات في تأكيد النتائج الإيجابية. يعدّ دليل WOAH من ظروف استعمال تفاعل البوليميراز المتسلسل في فقر الدم المعدي الخيلي أيضاً تأكيدَ العدوى المبكرة قبل تكوّن الأجسام المضادة في المصل، والتحققَ من خلو الخيول المعدّة لإنتاج الأمصال المضادة أو اللقاحات أو للتبرع بالدم من الفيروس، وتأكيدَ حالة المهر المولود لفرس مصابة. يرى دليل WOAH أن تحديد حالة الخيليات التي لم تبلغ 12 شهراً من فقر الدم المعدي الخيلي قد يتعين أن يقوم على التقنيات الجزيئية وحدها، لأن تفاعلاتها المصلية الإيجابية قد ترجع إلى أجسام مضادة منقولة من الأم. يذكر دليل MSD البيطري أن من مشكلات الاختبارات المصلية المتاحة لفقر الدم المعدي الخيلي أنها قد تعطي نتائج سلبية على أمصال جُمعت في بداية العدوى. يذكر مركز CFSPH بجامعة ولاية آيوا أن تفاعل البوليميراز المتسلسل بالنسخ العكسي على عينات الدم يمكن أن يستكمل الاختبارات المصلية لفقر الدم المعدي الخيلي أو يؤكدها، ولا سيما عند تعارض النتائج أو الاشتباه بالعدوى مع مصليات سلبية أو ملتبسة، وأنه قد يفيد في تحديد حالة المهور الحاملة لأجسام مضادة أمومية وفي التحقق من خلو المتبرعين بالدم من العدوى. يذكر مركز صحة الخيول في جامعة كاليفورنيا بديفيس أن مقايسات تفاعل البوليميراز المتسلسل بالنسخ العكسي مفيدة بخاصة في المهور المولودة لأفراس مصابة بفقر الدم المعدي الخيلي، لأن الصغار قد تحمل أجساماً مضادة أمومية. يذكر دليل MSD البيطري أن مقايسات كشف الفيروس، كتفاعل البوليميراز المتسلسل بالنسخ العكسي، لا تُستعمل روتينياً لتشخيص فقر الدم المعدي الخيلي، لكنها قد تفيد في البحث العلمي وفي المراقبة الفيروسية المفصلة.
تفسير النتيجة
يذكر مركز CFSPH بجامعة ولاية آيوا أن العيارات المصلية قد تتذبذب، وأن تقارير وصفت خيولاً مصابة بفقر الدم المعدي الخيلي كشفها تفاعل البوليميراز المتسلسل بالنسخ العكسي في الكريات البيض وبقيت سلبية مصلياً سنوات. يذكر Issel وزملاؤه أن تفاعل البوليميراز المتسلسل استُعمل بنجاح، رغم الصعوبات، لكشف تسلسلات فيروس فقر الدم المعدي الخيلي في خيول مصابة طبيعياً، وأن مقايسة متداخلة ضخّمت منطقة من الدنا الطليعي تحوي تسلسلات الجين gag لدى 88 من 112 حصاناً في إسطبلات سبق تشخيص المرض فيها، مقابل 81 حصاناً منها فقط كانت إيجابية في الاختبار المصلي. ينبّه دليل WOAH إلى أن عدم تطابق البادئات مع الفيروس المنتشر، الذي قد يعود إلى ارتفاع معدل الطفرات في فيروس فقر الدم المعدي الخيلي، قد يُفشل تفاعل البوليميراز المتسلسل في كشف الفيروس. يذكر دليل MSD البيطري أن مقايسات كشف فيروس فقر الدم المعدي الخيلي، على حساسيتها، قد لا تكشف الفيروس في الخيول الحاملة ذات الحمل الفيروسي المنخفض جداً في غياب تكاثر الفيروس، وأن التباين في مواقع ارتباط البادئات أو المسابير قد يُفقد الاختبار حساسيته مع الزمن ومن منطقة جغرافية إلى أخرى. يذكر مركز CFSPH بجامعة ولاية آيوا أن فيروس فقر الدم المعدي الخيلي متنوع جينياً، فقد لا تكشف مقايسات تفاعل البوليميراز المتسلسل بالنسخ العكسي بعض متغيراته، وأن مستوى الرنا الفيروسي قد يتذبذب فيتعذر كشف بعض الحيوانات المصابة ذات أعداد النسخ المنخفضة جداً في أوقات معينة. يذكر استعراض Sellon لعام 1993 أن بعض الخيول الحاملة لفقر الدم المعدي الخيلي دون أعراض ظاهرة تحمل في دمها المحيطي عدداً قليلاً جداً من الخلايا المصابة إلى حد قد يعطي معه تفاعل البوليميراز المتسلسل نتيجة سلبية كاذبة. يذكر Issel وزملاؤه أن العينات المأخوذة في فترات معينة من بعض الخيليات قد تعطي نتائج سلبية كاذبة عند فحصها بتفاعل البوليميراز المتسلسل لفيروس فقر الدم المعدي الخيلي. يطلب Issel وزملاؤه التزام الحذر عند استنتاج غياب فيروس فقر الدم المعدي الخيلي من نتيجة سلبية في تفاعل البوليميراز المتسلسل أو في العزل الفيروسي الروتيني، لأن احتمال بقاء الفيروس في مستودعات نسيجية أو في صورة كامنة لا يُستبعد دون تثبيط مناعي. تذكر دراسة Microbiology Spectrum لعام 2023 أن طرق الكشف القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي لم تكن فعالة دائماً حيث تختلف تسلسلات سلالات فيروس فقر الدم المعدي الخيلي بين البلدان، وأن دراسات قليلة أفادت بتعذّر كشف بعض عزلات الفيروس بالبادئات النوعية التي يوصي بها دليل WOAH. تشير دراسة Microbiology Spectrum لعام 2023 إلى أنه لا توجد حتى الآن طريقة عامة لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي للتشخيص السريري السريع لفقر الدم المعدي الخيلي، وتعزو ذلك أساساً إلى شدة تباين سلالات الفيروس. اختبرت دراسة Microbiology Spectrum لعام 2023 النوعية التحليلية لمقايستها الكمية القائمة على القطعة بين الجينين tat وgag على الأحماض النووية لفيروس فقر الدم المعدي الخيلي وفيروس التهاب الشرايين الخيلي وفيروسات خيلية أخرى وجرثومتي Salmonella abortusequi وStreptococcus equi، فلم تكشف المقايسة إلا فيروس فقر الدم المعدي الخيلي، وهو ما رأت فيه الدراسة دلالة على نوعية عالية. وجدت دراسة Microbiology Spectrum لعام 2023 في تجاربها المخبرية أن حد الكشف لمقايسة tat-gag الكمية بلغ نسخة واحدة في التفاعل وفق توزيع بواسون، وأن معدل الكشف بلغ 100% لأكثر من خمس نسخ من الدنا الطليعي والرنا الفيروسي من خلايا مصابة بسلالتي فيروس فقر الدم المعدي الخيلي UK3 وDLV2-6. تذكر دراسة Microbiology Spectrum لعام 2023 أن مقايسة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي التي قورنت بها مقايستها لم تكشف إلا السلالة الأمريكية UK3 من فيروس فقر الدم المعدي الخيلي والسلالات القريبة منها تطورياً، بينما كشفت مقايسة tat-gag جميع القوالب المختبرة.
مكانه في المعايير الدولية
يمنح الجدول 1 في فصل فقر الدم المعدي الخيلي من دليل WOAH تفاعل البوليميراز المتسلسل علامة «+/–» في غرضين من أغراضه الستة، وعلامة «–» التي يفسّرها مفتاح الجدول بأنها «غير مناسب لهذا الغرض» في الأغراض الأربعة الأخرى. يوصي الجدول 1 في فصل فقر الدم المعدي الخيلي من دليل WOAH بالجمع بين عدة طرق لتحديد العامل الممرض تُطبَّق على العينة السريرية الواحدة.