زرع Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (culture) هو، كما يصفه فصل نظير السل (داء جونز) في دليل المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH)، تلقيح البراز أو الأنسجة بعد معالجتها للتخلص من الملوثات في أوساط اصطناعية بعضها يحتوي المايكوباكتين وبعضها خالٍ منه، والمايكوباكتين عامل نمو لا غنى عنه لنمو هذه المتفطرة. يعدّ دليل WOAH عزل Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis من الحيوان التشخيص القاطع للعدوى بهذه المتفطرة المسببة لداء جونز.
ما الذي يكشفه الاختبار
يعرّف دليل WOAH نظير السل (داء جونز) بأنه التهاب معوي مزمن يصيب المجترات تسببه Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis، ويذكر أنه منتشر عالمياً ويوجد غالباً في المجترات الأليفة من أبقار وأغنام وماعز وإبليات وجواميس وفي المجترات البرية من الأيليات. يذكر دليل WOAH أن الاعتماد على المايكوباكتين استُعمل طويلاً صفةً تصنيفية لـMycobacterium avium subsp. paratuberculosis لأن معظم المتفطرات قادرة على صنع المايكوباكتين بنفسها، لكنه ينبه إلى أن هذه الحاجة لا تقتصر عليها بل توجد بدرجات متفاوتة داخل مجموعة M. avium.
العينة
يذكر مركز CFSPH بجامعة ولاية آيوا، في صفحته عن نظير السل، أن العينات الموصى بها عادةً للزرع تشمل اللفائفي والعقد اللمفية المساريقية واللفائفية الأعورية والكبد، مع أن الجرثوم قد يُكشف في مواضع أخرى أيضاً. يوصي دليل WOAH بشطف البراز عن أجزاء القناة المعوية قبل شحنها إلى المختبر لتجنب التلوث في فحص نظير السل. يذكر دليل WOAH أن أعداد Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis تكون أقل بكثير من أعداد الجراثيم أو الفطريات الأخرى في عينات البراز والأنسجة المعوية، وأن نجاح عزلها من هذه العينات يتوقف على التعطيل الفعال لتلك الكائنات غير المرغوبة. يصف مختبر تكساس إيه آند إم للتشخيص البيطري، في صفحته عن فحوص داء جونز، الزرع على الوسط الصلب بأنه كشف لـM. avium ssp. paratuberculosis في عينة براز، عالي النوعية لكنه يحتاج إلى وقت أطول لصدور النتيجة يبلغ 16 أسبوعاً. يرى دليل WOAH أنه ينبغي أن تُداوَل كائنات Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis والعينات المشكوك في عدواها وفق مستوى سلامة حيوية واحتواء يقرره تحليلٌ للمخاطر الحيوية.
مبدأ الاختبار
يذكر دليل WOAH أن طرق زرع Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis متعددة وتختلف في الأوساط وفي بروتوكولات معالجة العينات، وأن الزرع يُجرى دائماً على أوساط خاصة مدعّمة بالمايكوباكتين J المتوفر تجارياً. يذكر دليل WOAH أن بروتوكولات إزالة التلوث الروتينية ثبت أنها تخفض عدد كائنات Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis المعزولة من العينة بنحو 2.7 لوغاريتم عشري في البراز و3.1 في الأنسجة. يذكر دليل WOAH تقارير تفيد بأن الأوساط السائلة أعلى حساسية من الأوساط الصلبة لسلالات Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis الغنمية والبقرية، وأن حساسية الزرع قد تتحسن باستعمال الأوساط السائلة والطرد المركزي بدل الترسيب. تميّز الإجراءات التشخيصية القياسية لأستراليا ونيوزيلندا (2010) لداء جونز بين تقنيتين لعزل M. paratuberculosis، هما الزرع التقليدي على الأوساط الصلبة والزرع في الأوساط السائلة، وتذكر أن الثانية تختصر الوقت اللازم للنتيجة وتُعدّ الأعلى حساسية. يذكر دليل WOAH أن المستعمرات الأولية لـMycobacterium avium subsp. paratuberculosis على الأوساط الصلبة قد تظهر في أي وقت بين 5 أسابيع و6 أشهر بعد التلقيح. ينبغي، بحسب دليل WOAH، إثبات اعتماد Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis على المايكوباكتين بمقارنة نمو المستعمرات المشتبه بها على وسط يحتويه ووسط يخلو منه، ويلفت الدليل إلى أن المايكوباكتين جزء من جدار خلية الجرثومة وأن اللقاح الكثيف قد يحمل منه ما يكفي لنموها على الوسط الخالي منه. ينص دليل WOAH على أنه ينبغي أيضاً استعمال التأكيد بتفاعل البوليميراز المتسلسل، الذي يستهدف IS900 أو F57، لتأكيد هوية عزلات Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. ثلاث سمات تستند إليها عادةً عملية التعرف على عزلات M. paratuberculosis، بحسب الإجراءات التشخيصية القياسية لأستراليا ونيوزيلندا (2010): الاعتماد على المايكوباكتين، وبطء نمو العصيات الصامدة للحمض، ووجود القطعة IS900 من الحمض النووي التي تُعدّ فريدة في جينومها. لا ينبغي الحكم بسلبية الزرع الأولي لداء جونز على الأوساط الصلبة قبل حضن مطوّل قد يبلغ 6-8 أشهر، بحسب الإجراءات التشخيصية القياسية لأستراليا ونيوزيلندا (2010)، التي تذكر أيضاً أن السلالات الغنمية أضعف نمواً من البقرية. يذكر دليل MSD البيطري، في فصل نظير السل في المجترات، أن معظم سلالات Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis التي تصيب الأغنام لا تنمو على الأوساط الصلبة، لكنها قد تُعزل بأنظمة الزرع في الأوساط السائلة.
الاستعمالات
يذكر دليل WOAH أن الزرع البرازي يُعدّ على نطاق واسع المعيار الذهبي لتشخيص نظير السل في الحيوانات الحية المصابة. تذكر الإجراءات التشخيصية القياسية لأستراليا ونيوزيلندا (2010) الزرع البرازي بين الاختبارات المتاحة لتشخيص داء جونز في الحيوانات الحية. تذكر الإجراءات التشخيصية القياسية لأستراليا ونيوزيلندا (2010) أن معظم المختبرات في أستراليا ونيوزيلندا تستعمل الزرع في الأوساط السائلة للعزل الأولي لـM. paratuberculosis، بينما يُستعمل الزرع التقليدي على الأوساط الصلبة أساساً لتحديد اعتماد العزلات على المايكوباكتين. يذكر دليل MSD البيطري أن تفاعل البوليميراز المتسلسل حلّ محل الزرع في كشف Mycobacterium avium paratuberculosis، لأن الجرثوم ينمو ببطء شديد خلال 2-4 أشهر ولأن الزرع أعلى كلفة. يذكر مركز CFSPH بجامعة ولاية آيوا أن M. avium ssp. paratuberculosis ينمو ببطء، وأن نتائج زرعه قد لا تتوفر قبل عدة أسابيع أو أشهر بحسب السلالة ووسط الزرع.
تفسير النتيجة
يذكر دليل WOAH أن زرع Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis صعب تقنياً ويستغرق وقتاً طويلاً، لكنه الاختبار الوحيد الذي لا يعطي نتائج إيجابية كاذبة، أي أن نوعيته 100%. تذكر الإجراءات التشخيصية القياسية لأستراليا ونيوزيلندا (2010) أن عزل M. paratuberculosis من البراز أو الأنسجة يُعدّ نوعياً بنسبة 100%. ينبّه دليل WOAH إلى أنه من الممكن نظرياً، بسبب ظاهرة المرور العابر المحتملة، أن يعطي الزرع البرازي لحيوانات غير مصابة بنظير السل في مزارع ملوثة تفاعلات إيجابية كاذبة، مستشهداً بعمل Nielsen وToft (2008). يذكر دليل WOAH، مستشهداً بعدة دراسات، أن زرع أنسجة الأبقار والأغنام والماعز بحثاً عن Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis أعلى حساسية من الفحص النسيجي المرضي. تقترب حساسية الزرع البرازي لداء جونز من 100% في الحيوانات المصابة سريرياً، بينما لا يكشف إلا قليلاً من الحيوانات في بداية العدوى، وفق الإجراءات التشخيصية القياسية لأستراليا ونيوزيلندا (2010) التي تربط حساسيته بمرحلة العدوى لدى الحيوانات المفحوصة. تعدّ الإجراءات التشخيصية القياسية لأستراليا ونيوزيلندا (2010) الزروع التي تحمل مستعمرات ذات مظهر نموذجي وتعتمد على المايكوباكتين متوافقة مع M. paratuberculosis. يذكر مختبر تكساس إيه آند إم للتشخيص البيطري أن الزرع الإيجابي دليل قوي على العدوى بداء جونز، وأن الزرع السلبي لا يستبعد العدوى لأن Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis يُطرح على نحو متقطع.
مكانه في المعايير الدولية
يقيّم جدول طرق التشخيص في فصل نظير السل من دليل WOAH الزرع بدرجات تتفاوت بحسب الغرض، من «موصى به لهذا الغرض» إلى «غير مناسب لهذا الغرض»، مروراً بـ«مناسب في ظروف محدودة جداً»، وفق مفتاح الجدول.