المسابير الجينية وتفاعل البوليميراز المتسلسل (DNA probes and polymerase chain reaction) وسيلتان جزيئيتان يذكر فصل نظير السل في دليل المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) أن التشخيص السريري لـداء جونز يُؤكَّد بهما، كما يُؤكَّد بالفحص المجهري أو الزرع، من خلال إظهار Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis في البراز. يذكر دليل WOAH أن مسابير جينية يجري تطويرها لكشف Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis في العينات التشخيصية وللتعرف السريع على العزلات الجرثومية، وأنها استُعملت للتمييز بينها وبين المتفطرات الأخرى.
ما الذي يكشفه الاختبار
يصنّف دليل WOAH نظير السل (داء جونز) التهاباً مزمناً لأمعاء المجترات تُحدثه Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. يذكر دليل WOAH أن McFadden وزملاءه حددوا تسلسلاً سُمّي IS900، وهو تسلسل إدخال نوعي لـMycobacterium avium subsp. paratuberculosis. يذكر دليل WOAH أن تسلسلات جديدة من الحمض النووي تُعدّ فريدة لـMycobacterium avium subsp. paratuberculosis، هي ISMav2 وf57 وISMap02، توفر أدوات إضافية للتعرف السريع عليها بتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل. تنبّه الإجراءات التشخيصية القياسية لأستراليا ونيوزيلندا (2010) لداء جونز إلى أن اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل المبنية على التسلسلات الجديدة قد تكون حساسيتها التحليلية أقل، لأن عدد نسخ الحمض النووي الهدف منها في جينوم M. paratuberculosis أقل من نسخ IS900. يذكر دليل WOAH أن الحاملات المصابة دون أعراض تطرح أعداداً متفاوتة من Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis في البراز، وأن أعداداً أكبر تُطرح في معظم الحالات مع تطور المرض السريري. يبني دليل WOAH التعرف على Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis على حاجتها إلى المايكوباكتين وعلى ارتباطها بالعلامات السريرية وبنتائج مخبرية محددة مثل نتائج الزرع وتفاعل البوليميراز المتسلسل.
العينة
يذكر دليل WOAH أن طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي طُوّرت على نطاق واسع في السنوات الأخيرة لكشف Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis في عينات مختلفة هي الدم والحليب والبراز والأنسجة والعينات البيئية. يقبل مختبر تكساس إيه آند إم للتشخيص البيطري، في صفحته عن فحوص داء جونز، عينات البراز أو محتوى الأمعاء أو الأمعاء الطازجة لكشف الحمض النووي لـM. avium ssp. paratuberculosis بتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي. يذكر مركز CFSPH بجامعة ولاية آيوا، في صفحته عن نظير السل، أن M. avium ssp. paratuberculosis أو أحماضها النووية يمكن العثور عليها عند الصفة التشريحية في البراز والقناة المعوية والعقد اللمفية المرتبطة بها. يُحصر أخذ خزعة كاملة السماكة من اللفائفي والعقد اللمفية الإقليمية عادةً في الحيوانات ذات القيمة الخاصة، بحسب فصل نظير السل في المجترات من دليل MSD البيطري، مع أن فحصها بالزرع أو بتفاعل البوليميراز المتسلسل وبالتقييم النسيجي قد يتيح تشخيصاً قاطعاً. يربط دليل WOAH التعامل مع Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis ومع العينات المحتمل عدواها بمستوى من السلامة الحيوية والاحتواء ينبغي أن يُحدَّد بتحليل المخاطر الحيوية.
مبدأ الاختبار
تتأثر تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي كثيراً بجودة عينات الحمض النووي، وفق دليل WOAH، الذي يرى فيها مع ذلك طريقة سريعة تبعث الأمل في كشف الكائنات البطيئة النمو والصعبة الزرع مثل Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. يعدّ دليل WOAH طريقة استخلاص الحمض النووي التي توفر عينة عالية الجودة وأقصى استرجاع للحمض النووي الجرثومي خطوة حاسمة لاستعمال تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي في كشف متفطرة نظير السل. يذكر دليل WOAH أنه أُبلغ عن عدد قليل من عزلات غير Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis أعطت نواتج تضخيم بالحجم المتوقع من هذه المتفطرة في اختبارات تسلسل IS900. يذكر مركز CFSPH بجامعة ولاية آيوا أن مقايسات تفاعل البوليميراز المتسلسل لنظير السل سريعة وكثيراً ما تُستعمل في التشخيص، وأن طرقاً للتضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة نُشرت أيضاً.
الاستعمالات
يذكر دليل WOAH أن مقايسات تفاعل البوليميراز المتسلسل تحسنت إلى حد صار لها معه دور مهم في تشخيص نظير السل. يرى دليل WOAH أنه ينبغي تأكيد هوية عزلات Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis بتفاعل البوليميراز المتسلسل الموجّه إلى IS900 أو F57. يذكر دليل MSD البيطري أن تفاعل البوليميراز المتسلسل على عينات براز مجمّعة، أو على براز من مواقع في المزرعة تختلط فيها الأبقار، يمكن أن يحدد حالة القطيع من عدوى نظير السل بكلفة أقل، رغم بعض الانخفاض في حساسية الاختبار. تذكر الإجراءات التشخيصية القياسية لأستراليا ونيوزيلندا (2010) أن تشخيص داء جونز يقوم على الأسس السريرية ويُؤكَّد بإظهار M. paratuberculosis في البراز بالفحص المجهري أو الزرع أو التقنيات القائمة على الحمض النووي.
تفسير النتيجة
يذكر مختبر تكساس إيه آند إم للتشخيص البيطري أن النتيجة الإيجابية لتفاعل البوليميراز المتسلسل على البراز تدل على أن الحيوان يطرح عامل داء جونز ويشكل خطراً لنقل العدوى، وأن النتيجة السلبية لا تستبعد العدوى لأن الطرح قد يكون متقطعاً أو دون حدود الكشف. تتحسن الحساسية التشخيصية لاختبارات كشف M. paratuberculosis، ومنها المسابير الجينية والزرع والفحص النسيجي، مع ازدياد الحمل المتفطري في المراحل المتقدمة من العدوى، بحسب الإجراءات التشخيصية القياسية لأستراليا ونيوزيلندا (2010)، بعد أن تكون منخفضة في مراحلها المبكرة. يذكر دليل MSD البيطري أن مقايسة تفاعل البوليميراز المتسلسل لنظير السل أعلى حساسية ونوعية من الفحص المصلي، وأن عُدد تفاعل البوليميراز المتسلسل التجارية تضاهي الزرع البرازي في الحساسية والنوعية وهي أسرع منه بكثير وأقل كلفة.
مكانه في المعايير الدولية
ينبغي لمستخدمي اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل التشخيصية التجارية المتاحة لكشف Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis في الحليب والبراز، بحسب دليل WOAH، أن ينظروا في تفسير البيانات المحصلة وفي ملاءمة الطريقة للغرض قبل اعتمادها. يمنح جدول طرق التشخيص في فصل نظير السل من دليل WOAH تفاعل البوليميراز المتسلسل علامات تتراوح بحسب الغرض بين ثلاث علامات زائد وعلامة الناقص، ويوصي في حاشيته بالجمع بين عدة طرق للتعرف على العامل تُطبَّق على العينة السريرية نفسها.