اختبار التهجين الخطي العكسي (reverse line blot، ويُختصر RLB) طريقة جزيئية تقوم على تهجين نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مع مجسّات نوعية مثبّتة على غشاء من النيتروسليلوز، وفق المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH). تذكر WOAH في سياق داء الثايليريات في الأغنام والماعز أن Theileria lestoquardi هي العامل المسبّب لثايليريا الأغنام الخبيثة، وأن Theileria uilenbergi وT. luwenshuni طفيليان دمويان ممرضان للأغنام وُصفا في شمال غرب الصين.
ما الذي يكشفه الاختبار
تنتقل أنواع الثايليريا في الغالب عن طريق القراد الصلب، وفيه تحدث دورة التكاثر الجنسي والتبوغ لهذه الطفيليات، كما تفيد WOAH. يُعدّ جين الرنا الريبوسومي 18S، بحسب WOAH، أكثر الواسمات استعمالاً في توصيف أنواع الثايليريا، وهو شديد الحفظ بين الكائنات لكنه يضم مناطق متغيّرة تختلف من نوع إلى آخر. تذكر دراسة أولوجسمه وزملائه (2023) أن المنطقة المفرطة التغيّر V4 من هذا الجين هي التي تُصمَّم منها مجسّات الاختبار.
مبدأ الاختبار
ضخّم أولوجسمه وزملاؤه (2023) المنطقة المفرطة التغيّر V4 من جين الرنا الريبوسومي 18S لدى البيروبلازمات بتضخيم متداخل باستعمال البادئين RLB-F2 وRLB-R2 لمقايسة RLB، ثم هجّنوا نواتج PCR مع مجسّات خاصة بأجناس البابيزيا والثايليريا وأنواعهما مرتبطة بغشاء RLB. تضيف بعض صيغ البروتوكول تفاعل PCR متداخلاً أولياً لرفع حساسية الاختبار، بحسب WOAH. تُقرأ النتيجة على فيلم تظهر عليه بقعة سوداء عند تقاطع العيّنة مع المجسّ، وهي تدل على إشارة إيجابية لذلك الطفيلي، وفق WOAH. أتاحت تقنية RLB، بحسب أولوجسمه وزملائه (2023)، اكتشاف أنماط وراثية وأنواع كثيرة لم تكن معروفة من قبل في جنسي الثايليريا والبابيزيا.
الاستعمالات
تفيد WOAH بأن التعرف على طفيليات الثايليريا بالفحص المجهري صعب، ولا سيما عند حدوث عدوى مختلطة. تصف WOAH البيولوجيا الجزيئية بأنها مفيدة جداً في التعرف على أنواع الثايليريا وتصنيفها في العوائل الفقارية واللافقارية، وبأن تقنياتها أكثر حساسية من المجهر عادة. تشير WOAH إلى أن اللطاخات الدموية يستمر استعمالها في الغالب رغم تقدّم الطرق الجزيئية، بسبب ارتفاع كلفة هذه الطرق. تعدّ WOAH تحديد الحيوانات الحاملة للعدوى أمراً بالغ الأهمية عند نقل الحيوانات من المناطق الموبوءة إلى المناطق الخالية من المرض. تشكّل العدوى المشتركة بمسبّبات من الجنس نفسه مشكلة في الأمراض المنقولة بالقراد، ولمعالجتها سعى الباحثون إلى تطوير مقايسات شديدة الحساسية وعالية النوعية، وإن كانت معقّدة أحياناً وتحتاج إلى مختبرات متخصصة، بحسب WOAH.
تفسير النتيجة وحدوده
تصف WOAH اختبار RLB بأنه واسع التطبيق لحساسيته العالية وقدرته على التعرف على العدوى المشتركة، مع استثناءات قد تحدث حين تتأثر حساسيته بوجود عدوى مختلطة. تؤكد WOAH أن حساسية RLB تتأثر بشدة باستعمال بادئات شاملة، إذ يستنزفها النوع السائد في العيّنة فتُكبَت إشارة القوالب الأقل وفرة. أفاد أولوجسمه وزملاؤه (2023) بأن لطريقة RLB حدوداً في التفريق بين T. annulata وT. lestoquardi، فاستعانوا بتقنية تعدّد أشكال أطوال القطع المقيَّدة (RFLP) للتعرف على هذين النوعين. أجرى أولوجسمه وزملاؤه (2023) تحليل التسلسل على عيّناتهم لتأكيد أنواع الثايليريا والبابيزيا التي كشفها تحليل RLB. تنبّه WOAH إلى أن أنواع الثايليريا قد تبقى كامنة في الحيوان المصاب بحمل طفيلي منخفض جداً، وهو أحياناً لا يكفي لتنبيه الجهاز المناعي.