تفاعل البوليميراز المتسلسل بالنسخ العكسي (RT-PCR) القائم على هلام الأغاروز طريقة جزيئية يذكر دليل المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) أن عدة صيغ منها وُصفت للكشف النوعي عن المادة الوراثية لفيروس مرض الخيل الأفريقي، مستهدفةً القطعة الجينية 3 أو 7 أو 8 من الفيروس. يصف دليل WOAH تفاعل RT-PCR بأنه تقنية عالية الحساسية تتيح التعرف السريع على الحمض النووي لفيروس مرض الخيل الأفريقي في دم الحيوانات المصابة وفي أنسجتها الأخرى.
ما الذي يكشفه الاختبار
يعرّف فصل مرض الخيل الأفريقي في دليل WOAH هذا المرض بأنه مرض معدٍ غير سارٍ بالتماس، تنقله المفصليات إلى الفصيلة الخيلية، ويسببه فيروس من جنس orbivirus ذو حمض نووي ريبي مزدوج السلسلة ينتمي إلى فصيلة Reoviridae. من الطرق التي نجح بها التعرف على الحمض النووي الريبي لفيروس مرض الخيل الأفريقي، وفق دليل WOAH، طريقةُ تفاعل البوليميراز المتسلسل بالنسخ العكسي. يذكر دليل WOAH أن طريقة RT-PCR القائمة على هلام الأغاروز وطريقة RT-PCR الآنية قادرتان كلتاهما على كشف السلالات المرجعية للأنماط المصلية التسعة لفيروس مرض الخيل الأفريقي. تُعرف لفيروس مرض الخيل الأفريقي، بحسب دليل WOAH، تسعة أنماط مصلية متمايزة مستضدياً حُددت باختبار التعادل الفيروسي، ويُلاحظ تفاعل متصالب بين بعض أزواجها، ولا يحدث أي تفاعل متصالب مع فيروسات orbivirus الأخرى المعروفة. يذكر دليل WOAH أن ناقلين حقليين على الأقل يشتركان في نقل فيروس مرض الخيل الأفريقي، هما Culicoides imicola وC. bolitinos.
العينة
يعدّ دليل WOAH الدم الكامل غير المتخثر المأخوذ من الحيوانات المريضة في المرحلة الحموية المبكرة، وقطعاً صغيرة من الطحال والرئة والعقد اللمفية من الحيوانات النافقة، العينات المفضلة لتشخيص مرض الخيل الأفريقي. يرى دليل WOAH أن اختيار العينات ونقلها الآمن إلى المختبر جانب بالغ الأهمية في تشخيص مرض الخيل الأفريقي. يذكر دليل WOAH أن الحصول على تفاعل جيد يستلزم أن يُستخلص من العينة حمض نووي ريبي عالي الجودة لفيروس مرض الخيل الأفريقي. يذكر دليل WOAH أنه لا يوجد دليل على أن الإنسان يمكن أن يُصاب بأي سلالة حقلية من فيروس مرض الخيل الأفريقي، لا بمخالطة الحيوانات المصابة طبيعياً أو تجريبياً ولا بالتعامل مع الفيروس في المختبرات. يرى دليل WOAH أن العمل على فيروس مرض الخيل الأفريقي في المختبر ينبغي أن يتم ضمن احتواء ملائم يُقدَّر مستواه بتحليل المخاطر الحيوية.
مبدأ الاختبار
يوضح دليل WOAH أن جينوم فيروس مرض الخيل الأفريقي يتكون من حمض نووي ريبي مزدوج السلسلة، ولهذا يجب مسخ الحمض النووي المستخلص قبل إجراء تفاعل RT-PCR. توضع جميع المكونات اللازمة للنسخ العكسي وللتضخيم، في تفاعل RT-PCR لفيروس مرض الخيل الأفريقي كما يصفه دليل WOAH، داخل أنبوب التفاعل الذي يحتوي الحمض النووي الممسوخ. يذكر دليل WOAH أن الطريقة الأوسع استعمالاً بين مقايسات الهلام لفيروس مرض الخيل الأفريقي تعتمد بادئات تقابل طرفي القطعة الجينية 7، المشفّرة للبروتين VP7، فتضخّم هذه القطعة كاملة. يذكر دليل WOAH أن نواتج تفاعل RT-PCR لفيروس مرض الخيل الأفريقي تُحلَّل بالرحلان الكهربائي على هلام الأغاروز، وأن العينات الإيجابية تُظهر حزمة بطول 1179 زوجاً قاعدياً يمكن استعمالها قالباً في تفاعل تحديد التسلسل للحصول على تسلسل القطعة الجينية 7. يذكر دليل WOAH أن تفاعل RT-PCR الآني يتميز عن طرق RT-PCR القائمة على هلام الأغاروز في كشف فيروس مرض الخيل الأفريقي بسرعة التحليل وارتفاع الحساسية وملاءمته للأتمتة عالية الإنتاجية.
الاستعمالات
يعدّ دليل WOAH التشخيص المختبري لمرض الخيل الأفريقي أمراً لا غنى عنه، وينبه إلى أن علاماته السريرية وآفاته، على تميزها، قد تُخلط بما تحدثه أمراض أخرى في الخيل. يذكر دليل WOAH أن تفاعل RT-PCR حسّن كثيراً التشخيص المختبري لمرض الخيل الأفريقي برفع حساسية الكشف وتقصير الوقت اللازم للتشخيص. يرى دليل WOAH في تفاعل RT-PCR النوعي للنمط على الهلام، وفي تفاعل RT-PCR الآني بمسابر التهجين، وكلاهما موجّه إلى القطعة الجينية 2، وسيلةً سريعة لتنميط فيروس مرض الخيل الأفريقي في الدم وعينات الأنسجة. ينبغي بحسب دليل WOAH أن يُحدَّد النمط المصلي لفيروس مرض الخيل الأفريقي في أبكر مرحلة ممكنة من الفاشية، بالتعادل الفيروسي أو بتفاعل RT-PCR النوعي للنمط أو بتحديد التسلسل، كي يُختار اللقاح الصحيح. يذكر دليل WOAH أنه ينبغي، إن أمكن، إجراء أكثر من اختبار لتشخيص فاشية مرض الخيل الأفريقي، ولا سيما الحالة الأولى فيها. يُوصى في فصل مرض الخيل الأفريقي من دليل WOAH بتطبيق أكثر من طريقة للتعرف على العامل الممرض معاً على عينة سريرية واحدة.
تفسير النتيجة
لا تعني النتيجة الإيجابية لتفاعل RT-PCR بالضرورة وجود فيروس مرض الخيل الأفريقي المعدي، بحسب دليل WOAH، لأن التفاعل يلتقط الحمض النووي النوعي للفيروس حتى بعد أن يفقد حيويته وقدرته على إصابة الحشرات أو خلايا الثدييات من جديد.
مكانه في المعايير الدولية
يصف جدول دليل WOAH لمرض الخيل الأفريقي تفاعل RT-PCR القائم على هلام الأغاروز بأنه غير مناسب لإثبات خلو مجموعة حيوانية من العدوى، ولا لتحديد الحالة المناعية بعد التحصين. يقرّ دليل WOAH بغياب أي معايير دولية حالياً لفيروسات مرض الخيل الأفريقي أو لكواشف تشخيصه، وبعدم وجود منهجية قياسية للتعرف على فيروس مرض الخيل الأفريقي. يذكر دليل WOAH أن المختبرات المرجعية للمنظمة الخاصة بمرض الخيل الأفريقي أجرت عام 2015 اختباراً دولياً مشتركاً بين المختبرات لجمع معلومات عن أداء الطرق المختلفة المستعملة في مختبرات التشخيص الرئيسية لفيروس مرض الخيل الأفريقي. يذكر دليل WOAH أن الاختبار الدولي المشترك لعام 2015 حول مرض الخيل الأفريقي قيّم عشرة بروتوكولات مختلفة لتفاعل RT-PCR، وأن بعضها لم يُختبر إلا في مختبر أو مختبرين لكنه أعطى نتائج جيدة جداً تجعله مناسباً لمزيد من التقييم والمصادقة. يذكر دليل WOAH أن الاختبار الدولي المشترك لعام 2015 حول مرض الخيل الأفريقي بيّن أن طريقتي RT-PCR الآني اللتين نشرهما Agüero وزملاؤه (2008) وGuthrie وزملاؤه (2013) كشفتا بشكل صحيح جميع السلالات الممثلة المشمولة فيه، مع حساسية عالية في تحليل العينات الحقلية. يذكر دليل WOAH أن دراسات أُجريت على عدة مقايسات من تفاعل البوليميراز المتسلسل بالنسخ العكسي لفيروس مرض الخيل الأفريقي أعطت مستوى عالياً من التوافق.