اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل الآني (Real-time PCR) لفيروس الهربس البقري من النوع 1 (BoHV-1) طريقة جزيئية تكشف الحمض النووي للفيروس في الأبقار. تصف المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) نسخة من هذا الاختبار طُوّرت لكشف BoHV-1 في السائل المنوي البقري المخفف المعدّ للتجارة.
ما الذي يكشفه الاختبار
يكشف الاختبار الحمض النووي لفيروس BoHV-1، وهو فيروس تضعه المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) في جنس Varicellovirus من الفصيلة الفرعية Alphaherpesvirinae ضمن عائلة Herpesviridae. ينطوي جينوم فيروس BoHV-1 على حمض نووي مزدوج الشريط يشفّر نحو 70 بروتيناً، بحسب WOAH. صُمّمت المقايسة الآنية الموصوفة في دليل WOAH لكشف الحمض النووي الفيروسي لجميع سلالات BoHV-1، ومنها النمطان الفرعيان 1 و2، في السائل المنوي البقري المخفف. تضخّم المقايسة الآنية الخاصة بالسائل المنوي تسلسلاً طوله 97 زوجاً قاعدياً من جين البروتين السكري B (gB)، وفق دليل WOAH. ذكرت WOAH أن جينات TK وgB وgC وgD وgE استُخدمت أهدافاً لتضخيم BoHV-1 بتقنية PCR. تضيف WOAH أن تفاعلات PCR المعتمدة على تسلسلات gE تُستعمل للتفريق بين الفيروس البري واللقاحات المحذوفة منها gE. أُبلغ في عام 2011 عن اختبار آني ثلاثي الأهداف يكشف جيني gD وgE لـ BoHV-1 مع جين منزلي، وفق ما يورده دليل WOAH. يمكن لتقنية PCR كشف الحمض النووي الحلقي للفيروس غير المتكاثر في العقد الحسية، كالعقدة الثلاثية التوائم، خلال طور الكمون، كما تذكر WOAH.
العينة
تنص WOAH على أن عينات هذا الاختبار هي في العادة سائل منوي بقري مخفف محفوظ في النيتروجين السائل. يوصي دليل WOAH بمعالجة ثلاث قشّات من كل دفعة من السائل المنوي. يذكر دليل WOAH أن حفظ السائل المنوي عند 4 درجات مئوية مدة قصيرة، تصل إلى 7 أيام، لا يؤثر في نتيجة PCR. استُعملت المسحات الأنفية عينةً للكشف الجزيئي بتقنية PCR الآنية في دراسة ترصّد عن التهاب الأنف والقصبة الهوائية المعدي البقري أُجريت في كازاخستان.
مبدأ الاختبار
تعتمد المقايسة الآنية الموصوفة في دليل WOAH على زوج من البادئات النوعية لتضخيم الحمض النووي المستهدف وعلى مجس أوليغونوكليوتيدي ذي نشاط نكلياز من الطرف الخامس لكشف نواتج التضخيم. يسبق التضخيم استخلاص الحمض النووي لـ BoHV-1 من السائل المنوي براتنج Chelex-100 الخالب مع إنزيم البروتيناز K ومركّب ثنائي الثيوثريتول. بحسب مراجعة نُشرت عام 2025 في مجلة Frontiers in Veterinary Science، تنقل تقنية PCR الآنية تحليل الأحماض النووية الفيروسية من المستوى النوعي إلى المستوى الكمي. تذكر المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) أن خطر التلوث ينخفض انخفاضاً ملحوظاً في تقنيات PCR الأحدث مثل PCR الكمية الآنية.
الاستعمالات
تذكر WOAH في فصلها عن التهاب الأنف والقصبة الهوائية المعدي البقري أن تقنية PCR، وبخاصة الآنية منها، تزداد استعمالاً في التشخيص الروتيني لكشف الحمض النووي للفيروس. تتميز PCR، مقارنة بعزل الفيروس، بأنها أكثر حساسية وأسرع، إذ يمكن إنجازها في يوم إلى يومين بحسب دليل WOAH. أظهرت تجربة أوردها دليل WOAH على عينات سائل منوي مخفف بصفار البيض من ثيران مصابة تجريبياً أن PCR كشفت عدداً من العينات الإيجابية يعادل خمسة أضعاف ما كشفه عزل الفيروس.
تفسير النتيجة
من عيوب تحاليل PCR، بحسب دليل WOAH، قابليتها للتلوث، ما يستوجب احتياطات تمنع النتائج الإيجابية الكاذبة. يوصي دليل WOAH بأن تتضمن كل دورة PCR عينات ضابطة إيجابية وسلبية وضوابط للكواشف. تُعدّ العينة التي لا تُظهر قيمة Ct (عتبة الدورة) سلبية بحسب الإجراء الوارد في دليل WOAH. يذكر دليل WOAH أنه لا يمكن استبعاد النتائج السلبية الكاذبة في مقايسات PCR. للكشف عن النتائج السلبية الكاذبة المحتملة في عينات السائل المنوي، يوصي دليل WOAH بإضافة قالب ضابط داخلي إلى أنبوب التفاعل يُضخَّم بالبادئات نفسها. أفادت مراجعة Frontiers in Veterinary Science لعام 2025 بأن مقايسة TaqMan لجين gB من BoHV-1 التي أنشأها Wang وزملاؤه لم تُظهر تفاعلاً متصالباً مع فيروسات أخرى. سجلت دراسة الترصّد في كازاخستان إيجابية PCR بنسبة 11.2% في عام 2024 مقابل 0.43% في عام 2025، وعدّها الباحثون دليلاً على دوران تحت سريري للفيروس وإفراز متقطع له. كانت جميع محاولات عزل الفيروس في دراسة الترصّد بكازاخستان سلبية، وهو ما رأى الباحثون أنه يتسق مع حمل فيروسي منخفض وعدوى كامنة.
مكانه في المعايير الدولية
تصف المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) أنظمة PCR الآنية بأنها الطرائق المختارة لتعزيز حساسية وخصوصية PCR الخاصة بـ BoHV-1. توصي المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) بطريقة PCR في جميع الحالات للكشف المباشر عن BoHV-1. صودقت المقايسة الآنية المخصصة للسائل المنوي المعدّ للتجارة وفق الفصل 1.1.6 من دليل WOAH، بمشاركة ستة مختبرات متعاونة في مقارنة دولية بين المختبرات.