يكشف تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي الآني (real-time RT-PCR) الحمض النووي الريبي لفيروس الإسهال الفيروسي البقري (BVDV) في الأبقار، ويُستعمل بحسب المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) مع اختبارات كشف المستضد الفيروسي لدى الحيوانات الحية والنافقة. تصنّف WOAH فيروس BVDV ضمن الفيروسات الحمّية (Pestivirus) من فصيلة Flaviviridae، وتذكر أنه وثيق القرابة بفيروس حمى الخنازير الكلاسيكية وفيروس مرض الحدود في الأغنام.
ما الذي يكشفه الاختبار
يستهدف الاختبار الجينوم الفيروسي، وتوصي المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) باختيار البادئات في مناطق شديدة الحفظ من الجينوم، والأفضل أن تكون المنطقة غير المترجمة 5′ أو جين NS3 (p80). تشمل المقايسات المنشورة التي تذكرها المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) نوعاً واسع التفاعل عبر جنس الفيروسات الحمّية، يكشف جميع أنماط BVDV وبعض سلالات فيروس مرض الحدود. تذكر المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) أن مقايسات RT-PCR الآنية القائمة على مجسّات DNA موسومة بمادة متألقة يمكن أن تُستعمل أيضاً للتمييز بين الفيروسات الحمّية. تشير دراسة نُشرت في مجلة Viruses عام 2024 عن فيروسات حمّية جديدة رُصدت في الأبقار إلى أن التمييز بين BVDV وفيروس مرض الحدود قد يكون حاسماً لتدابير مكافحة مناسبة ومراقبة فعّالة.
العينة
تتيح المقايسة، بحسب المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH)، كشف الحمض النووي الريبي الفيروسي مباشرة في طيف واسع من العينات، منها المصل والدم الكامل والأنسجة والحليب والسائل المنوي. تذكر المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) أن مثبّطات تفاعل البوليميراز تُصادَف في العينات المجموعة في دم معالج بالهيبارين أكثر مما تُصادَف في الدم المعالج بمادة إدتا (EDTA). في فحص السائل المنوي بهذه الطريقة وحدها، تقبل المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) إرسال العينات مبرّدة بشرط أن تبقى باردة عند وصولها إلى المختبر. توصي المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) بمعالجة ثلاث قشّات على الأقل من كل دفعة جمع للسائل المنوي.
مبدأ الاختبار
تصف المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) طريقة RT-PCR المعتمدة على الهلام بأنها كثيرة الجهد نسبياً ومكلفة وعرضة للتلوث المتصالب. تراجعت مشكلات RT-PCR المعتمد على الهلام بصورة ملحوظة، بحسب المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH)، بعد إدخال طرائق RT-PCR الكمّية أو الآنية القائمة على المجسّات. عند فحص السائل المنوي يُستخلص الحمض النووي الريبي لـ BVDV أولاً بطريقة استخلاص مُصادَق عليها، وتوصي المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) بأنظمة الحبيبات المغنطيسية لالتقاط الحمض النووي وتنقيته. تعتمد مقايسة RT-PCR الآنية الشاملة للفيروسات الحمّية التي تصفها المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) على تضخيم انتقائي لتسلسل من 208 أزواج قاعدية في المنطقة غير المترجمة 5′ من جينوم الفيروس الحمّي.
الاستعمالات
تصف المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) مقايسات كشف الحمض النووي الريبي بأنها مفيدة لأنها سريعة وعالية الحساسية جداً ولا تعتمد على الزرع الخلوي. بحسب المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH)، تتيح الحساسية التحليلية العالية فحص مجمّعات من العينات الفردية أو حليب خزان الحليب الكلي، وبهذا النهج يمكن التعرف على وجود حيوان واحد أو أكثر مصاب بعدوى مستديمة (PI) في قطعان تضم عدة مئات من الأبقار. لإثبات خلو عينات السائل المنوي من BVDV، تعدّ المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) هذا التفاعل أداة أثبتت فائدتها الكبيرة.
تفسير النتيجة
تحذّر المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) من أن كشف الحمض النووي الريبي الفيروسي لا يعني بحد ذاته وجود فيروس معدٍ، ولذلك يلزم الحذر في تفسير النتائج حتى مع الحساسية العالية للتفاعل. في قراءة نتيجة التفاعل، تعدّ المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) كل عينة لا تُسجَّل لها قيمة عتبة الدورة (Ct) عينة سلبية. لتحديد النتائج السلبية الكاذبة المحتملة توصي المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) بإضافة قالب حمض نووي ريبي خارجي («ضابط داخلي») إلى العينة قبل استخلاص الحمض النووي الريبي. ترى المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) أنه ينبغي معالجة عينة سلبية واحدة على الأقل بالتوازي لرصد احتمال حدوث تلوث منخفض المستوى. لا ترى المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) أن تجميع عينات الدم المأخوذة من العجول بين اليوم 7 واليوم 40 من العمر مناسب إذا كانت قد تناولت اللبأ الذي يحوي أضداداً ضد BVDV.
مكانه في المعايير الدولية
توصي المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) في فصل الإسهال الفيروسي البقري من دليلها لعام 2024 باستعمال مقايسة حساسة واسعة التفاعل في التطبيقات التشخيصية، لأن انتقال الفيروسات الحمّية المختلفة بين الأنواع يُصادَف أحياناً. يقرن فصل الإسهال الفيروسي البقري في دليل المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) بين مقايسة ELISA لكشف المستضد وRT-PCR الآني، ويصف كلاً منهما بأنه عالي الحساسية نسبياً وواسع الاستعمال.