ما الذي يكشفه
يجمع هذا النهج بين تفاعل البوليميراز المتسلسل بالنسخ العكسي (reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR) في صيغته التقليدية وتحديد التسلسل (sequencing)، ولا يقف دوره عند التشخيص بل يمتد إلى تقدير إمراضية الفيروس والتعرف على هويته.
المبدأ
لا تكتسب جسيمات APMV-1 قدرتها على العدوى إلا إذا انشطر البروتين السكري الأولي F0 (precursor glycoprotein)، الذي تُنتَج به أثناء التضاعف، إلى F1 وF2؛ وقد أُدرج تحديد موقع هذا الانشطار (cleavage site) في التعريفات المتفق عليها، بعدما غدا الطريقة المختارة لأول تقدير لإمراضية هذه الفيروسات، سواء جرى بتحديد التسلسل أو بطرق أخرى. وتحمل الصيغة التقليدية من RT-PCR خطرًا على المختبر نفسه: فالناتج يحتاج بعد التضخيم إلى معالجة، وهذه المعالجة ترفع احتمال تلوث المختبر وتلوث العينات بعضها من بعض، ولذلك تُعدّ التحدي الأكبر في استعمال هذه الصيغة للتشخيص.
متى يُستخدم
- تعريف ضراوة الفيروس: يكون ذلك عادة بقراءة تسلسل جين واحد مستهدف هو جين F، خلال 24-36 ساعة، بطريقة سانغر (Sanger sequencing) التي يمتد استعمالها الواسع لعقود وما زالت فائدتها واسعة.
- التعرف على هوية الفيروس: أقرب تسلسل معروف في قواعد البيانات الجينية إلى تسلسل جين F أو جين HN هو ما يدل على هوية الفيروس، والمقارنة بينهما تجري بسرعة.
تفسير النتيجة
وتحدّ من الاعتماد على نتيجة هذا النهج وحدها ثلاثة أمور:
- قد لا تكشف الاختبارات المتاحة حاليًا بعض المتغيرات (variants)، فتبقى فائدتها محدودة، والسبب تباين منطقة F0 التي تشفّر موقع الانشطار.
- احتمال وجود مجموعة مختلطة من فيروسات ضارية وأخرى غير ضارية، أو عدم تطابق البادئات (primer mismatch): وكلاهما يُبقي عزل الفيروس وتقدير ضراوته داخل الكائن الحي (in vivo)، كمؤشر الإمراضية داخل المخ (intracerebral pathogenicity index, ICPI)، أمرًا مطلوبًا.
- للتثبت من خلوّ العينة من مجموعات فرعية (subpopulations) ضارية من الفيروس، ينبغي تأكيد النتيجة الأولية لطريقة سانغر عن موقع انشطار F0، إما بحقن الطيور وإما بتحديد التسلسل العميق (deep sequencing) عالي الإنتاجية بما لا يقل عن 1000 قراءة.
مكانه في دليل المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH)
ولا يُلغي تقديمُ المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) لهذا النهج مكانةَ عزل الفيروس، الذي يظل أداة مخبرية مهمة، وإن كان RT-PCR المصادق عليه (validated) مع تحديد التسلسل هو طريقة التشخيص المفضلة لديها.