تفاعل البوليميراز المتسلسل بالنسخ العكسي الآني لفيروس نيوكاسل

ما الذي يكشفه

بفضل ما يقدمه من تشخيص سريع وحساس لفيروس نيوكاسل (Newcastle disease virus, NDV)، وإتاحته بإنتاجية عالية (high throughput)، صار تفاعل البوليميراز المتسلسل بالنسخ العكسي الآني (real-time RT-PCR) الطريقة المفضلة حاليًا لترصد الفيروس.

المبدأ

تحمل الصيغة التقليدية من RT-PCR خطر تلوث المختبر وتلوث العينات بعضها من بعض بسبب معالجة الناتج بعد التضخيم، والصيغة الآنية إحدى طرق الالتفاف على هذه المشكلة: فهي تقوم على مجسات تحلل مائي متألقة (fluorogenic hydrolysis probes) أو أصباغ متألقة (fluorescent dyes) تُلغي تلك الخطوة، ويمكن أن تعطي النتيجة في بضع ساعات. واستهداف جين شديد الحفظ (highly conserved gene) يتخطى التباين الواسع في جيني الاندماج (fusion, F) والراصّة الدموية-النورامينيداز (haemagglutinin-neuraminidase, HN). وتنجح مقايسة مبنية على جين L في كشف سلالات الصنف الأول (class I) والصنف الثاني (class II) كليهما بحساسية وموثوقية، بعد مصادقة واسعة شملت طيفًا عريضًا من الأنماط الجينية (genotypes). ولم تكن كل المقايسات بهذا الشمول، كما تروي مراجعة علمية:

• مقايسة qPCR المتعددة للمصفوفة والبوليميراز (matrix-polymerase multiplex qPCR): مقايسة محسّنة صُممت بادئاتها (primers) ومجسها (probe) على منطقة محفوظة من جين L في الصنف الأول، وكان الدافع إلى تطويرها أن معظم عزلات هذا الصنف كثيرًا ما أفلتت من مقايسة سابقة.
• ليسين (lysine, K) في الموضع 114 من موقع انشطار F بدل الغلوتامين (glutamine, Q) المعتاد: هذا ما حملته بعض العزلات التي أفلتت من توليفة معينة من البادئات والمجس، كما كشف التقصي اللاحق.

وفي تفاعل واحد وخطوة واحدة، تجمع مقايسة real-time RT-PCR متعددة (multiplex) طوّرتها دراسة وصادقت عليها بين مهمتين: كشف جميع الأنماط الجينية للصنف الثاني من الفيروس، والتمييز بين الأنماط المرضية الضارية (شديدة الضراوة ومتوسطتها) وغير الضارية (ضعيفة الضراوة وعديمة الأعراض).

تفسير النتيجة

وللنتيجة الإيجابية في الفرز خطوات لاحقة تذكرها المنظمة:

• لمعرفة ضراوة الفيروس ونمطه الجيني (genotype): يُحدَّد تسلسل جين F، إذ تُقرأ الضراوة من موقع الانشطار البروتيني (proteolytic cleavage site) فيه، ويأتي ذلك بعد تأكيد الكشف بمقايسة الفرز الحساسة والشاملة.
• قد يلزم تحديد تسلسل موقع انشطار جين الاندماج مباشرة، أو عزل الفيروس وتحليله بالطرق الكلاسيكية، حين تتعارض النتائج: طيور في فاشية تحمل علامات متوافقة مع فيروس نيوكاسل، إيجابية في الفرز، لكنها سلبية في اختبارات real-time RT-PCR الخاصة بجين الاندماج الضاري.

مكانه في دليل المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH)

يوصي دليل المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) باختبار فرز بتقنية real-time RT-PCR يتعرف على فيروسات APMV-1 الضارية وغير الضارية معًا.