يكشف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) التقليدي (Mycoplasma gallisepticum, M. synoviae Conventional PCR) الحمض النووي للمفطورتين الطيريتين Mycoplasma gallisepticum (MG)، التي تُعرف عدواها بـالعدوى بالمفطورة الدجاجية الإنتانية، وMycoplasma synoviae (MS)، وذلك بتضخيمه ببادئات نوعية لكل منهما. تصف المنظمة العالمية لصحة الحيوان (WOAH) اختبارات PCR بأنها مستعملة روتينياً في مختبرات كثيرة وتتميز بحساسية جيدة.
ما الذي يكشفه الاختبار
يقوم الفحص الذي يصفه دليل WOAH البري للمفطورات الطيرية على تضخيم جزء من الجين الريبوزومي 16S rRNA لكشف MG وMS، ويصفه الدليل بأنه PCR مثبَّت الصلاحية. تورد WOAH كذلك طريقة أخرى واسعة الاستعمال تكشف MG عبر الجين mgc2. سجّل الجين mgc2 في دراسة مصرية نُشرت في مجلة Pathogens عام 2023 أعلى نسبة إيجابية بين الجينات المفحوصة، بينما سجّل الجين IgT أدناها. اعتمدت دراسة تونسية نُشرت في BMC Veterinary Research عام 2024 على PCR نوعي للجنس مبني على 16S rRNA للكشف عن الحمض النووي للمفطورات في كل عينة، واستعملت فحصي PCR نوعيين للكشف عن MS وMG في العينات.
العينة
تحدد WOAH المسحات مادةً لاستخلاص الحمض النووي، وتجيز جمع ما يصل إلى 10 مسحات في استخلاص واحد. أخضعت دراسة ماليزية نُشرت في Poultry Science عام 2025 ما مجموعه 407 مسحات من شق المنخر الخلفي (choanal cleft) جُمعت من مزارع دواجن مختلفة في وسط شبه الجزيرة الماليزية للعزل ولـPCR. استُخلص الحمض النووي في الدراسة الماليزية من مزارع مرقية بطريقة التحلل بالغليان، بعد أربع وعشرين ساعة من حضن العينات.
مبدأ الاختبار
يُحضَّر خليط التفاعل، بحسب WOAH، في منطقة نظيفة منفصلة باستعمال مجموعة ماصّات مخصصة لذلك، وفق تعليمات الشركة المصنِّعة. يمكن، بحسب WOAH، إدخال شاهد تضخيم داخلي (IAC) في التفاعل، إما بمجموعة تجارية خارجية المنشأ وإما ببادئات مصممة لتسلسل داخلي المنشأ، مثل 18S rRNA في العينات المشتقة من حقيقيات النوى. تنص WOAH على تشغيل حمض نووي شاهد إيجابي وآخر سلبي في كل تحليل. تُكشف نواتج التضخيم في الطريقة التقليدية بالترحيل الكهربائي الهلامي مع واسمات حجم مناسبة، وتُرى النواتج الملوّنة تحت الأشعة فوق البنفسجية أو بنترات الفضة داخل خزانة للمواد الكيميائية الخطرة، كما تذكر WOAH. تذكر WOAH بديلاً هو تشغيل الناتج المضخَّم في جهاز ترحيل شعري مع واسمات حجم مناسبة، وتنبّه إلى أن أحجام القطع بالأزواج القاعدية قد تختلف إحصائياً بنحو 10% عما هو متوقع بهذه الطريقة. رُحّلت نواتج التضخيم في الدراسة المصرية على هلام أغاروز تركيزه 1%، ووُثّقت بجهاز إضاءة بالأشعة فوق البنفسجية بعد التلوين ببروميد الإيثيديوم. صُمّم في الدراسة الماليزية PCR متعدد (multiplex) لكشف MG وMS باستعمال بادئات الجينين mgc2 وvlhA على التوالي.
الاستعمالات
تذكر الدراسة الماليزية أن طرائق الكشف الجزيئي مثل PCR يتزايد استعمالها في المختبرات التشخيصية لأنها تتيح بدائل أسرع وأكثر حساسية من العزل. وصفت الدراسة المصرية تقنيات الزرع التقليدية بأنها مجهِدة ومكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً. تذكر WOAH أن PCR الآني بمجسّات فلورية يتزايد استعماله ويقصّر زمن الكشف مقارنة بـPCR التقليدي.
تفسير النتيجة
تنبّه WOAH إلى أن سلالات غير متقاربة قد تشترك أحياناً في تسلسلات من الحمض النووي، فتعطي حزم تضخيم في ظروف مختبرية مختلفة. تذكر WOAH أن PCR التقليدي لـMS الوارد في فصلها قد يكشف كذلك الحمض النووي لـM. bovirhinis. تذكر WOAH أن تقنية الترحيل الهلامي بتدرج مُمسِخ (DGGE) المبنية على PCR يمكن تطبيقها للتعرف على معظم المفطورات الطيرية، ومنها MG وMS، لكن صلاحية هذا الاختبار مثبتة فقط على عزلات من زرع المفطورات. اعتمدت الدراسة المصرية qRT-PCR من المرق مرجعاً، وسجّل فيها كل من PCR من المرق وqRT-PCR من المسحات أعلى حساسية بنسبة 77.55% ومساحة تحت المنحنى 0.888، بدقة بلغت 80.00%.